Hericium erinaceus kod ljudske leukemije

Hericium erinaceus kod ljudske leukemije

Food Funct., 2011, 2, 348

DOI: 10.1039/c1fo10030k

Autori:  Sung Phil Kim, Mi Young Kang, Yong Hee Choi, Jae Ho Kim, Seok Hyun Nam and Mendel Friedmane

Mehanizam apoptoze monocitnih ćelija ljudske leukemije U937 indukovana gljivom Hericium erinaceus (Yamabushitake)

Fitohemikalije u nekim namirnicama su potencijalni izvor bezbednih bioaktivnih jedinjenja za hemoprevenciju karcinoma i suzbijanje inicijacije, razvoja i metastaza tumora. U ovoj studiji smo testirali toplovodni ekstrakt (HWE), etanolski ekstrakt 50% zagrevan u mikrotalasnoj peći (MWE), kiseli ekstrakt (ACE) i alkalni ekstrakt (AKE) iz plodonosnog tela (sporocarp) gljive Hericium erinaceus (Yamabushitake, lavlja griva) po osnovu njene sposobnosti da indukuje apoptozu (programiranu ćelijsku smrt) monocitnih ćelija ljudske leukemije U937. Testovi ćelijske kulture, vitalnosti, citotoksičnosti, protočne citometrije, hromozomskog integriteta DNK, membranskog potencijala mitohondrija, ekspresije pro- i anti-apoptotočkih proteina i aktivacije i inhibicije kaspaze, su izvedeni da pomognu da se definiše mehanizam posmatrane apoptoze. Vodeni i vodeno/etanolski ekstrakti su bili aktivni u svim testovima, dok su kiseli i alkalni ekstrakti sa sličnim bliskim sastavima, bili neaktivni. Rezultati biotestova sa aktivnim ekstraktima su u skladu sa mehanizmom apoptoze koji uređuje supresiju proliferacije ćelija putanjom koja uključuje aktivaciju mitohondrijama posredovanih kaspaze-3 i kaspaze-9, ali ne i kaspaze-8. Neposredna analiza  praha gljive, osušene zamrzavanjem, je pokazala da sadrži velike količine proteina, ugljenih hidrata i minerala. Rezultati pokazuju da gljive H. erinaceus mogu imati terapeutski potencijal protiv ljudske leukemije.

Uvod

Hericium erinaceus, pod nazivom ,,Yamabushitake” u Japanu ili ,,Houtou” u Kini, respektivno, predstavlja jednu jestivu i lekovitu gljivu klase Aphillophorales, Hidnaceae (Hericiaceae). U prethodnoj studiji, pokazali smo da su dva ekstrakta pripremljena od plodonosnog tela H. erinaceus uzlazno regulisala proizvodnju azotnog oksida (NO) i fagocitoza kod ćelijamakrofaga miša RAV264.7, ukazujući na moguću anti-kancer aktivnost preko povećanja imuniteta domaćina. Da bismo postavili ispod opisane nalaze u odgovarajuću perspektivu, prvo ćemo ukratko spomenuti izabrana prijavljena zapažanja o antikarcinogenim i terapeutskim aspektima gljiva u hronološkom redu.

Vodeni ekstrakt gljive Šiitake (Lentinus edodes) indukuje apoptozu ćelija U937 povezanih sa smanjenom proizvodnjom IL-1. Etanolski ekstrakti micelijuma Lentinula edodes, značajno su smanjili proliferaciju i indukovali apoptozu kod ćelija karcinoma (CH72) mišje kože preko prolaznog zaustavljanja G1. Lektin gljive indukuje apoptozu u ćelijama U937 preko ćelijskog ciklusa G2/M povezanog sa uzlaznom regulacijom manifestacije p21/Waf1, smanjenjem manifestacije Bcl-2, poboljšanim oslobađanjem citohroma-c iz mitohondrija do citoplazme i sa aktiviranjem kaspase-9 u tretiranim ćelijama. Izolovani oblik polisaharida H. erinaceus uzlazno je regulisao funkcionalne događaje posredovane makrofagama u ćelijama RAV264.7 kao što su: proizvodnja azotnog oksida (NO) i ekspresija citokina (IL-1b i TNF-a). Prečišćeni polisaharid iz plodonosnog tela H. erinaceus je poboljšao apoptozu indukovanu doksorubicinom u ćelijama humanog hepatokarcinoma, preko senzitizacije apoptozne signalizacije posredovane doksorubicinom smanjivanjem ekspresije c-FLIP. Ubikuinone-9 izolovan iz hloroformnog ekstrakta gljivee Pleurotus eryngii je indukovao apoptozu u ćelijama U937 preko fragmentacije DNK u apoptotsku lestvicu DNK i inhibicije aktivnosti topoizomeraze. Dodatak micelijuma H. erinaceus mišjoj ishrani je izazvao anti-inflamatorne efekte preko podizanja nivoa plazma glutationa (GSH) i poboljšanja kod oksidativnog stresa jetre. Japanski muškarci i žene starosti od 50 do 80 godina koji su se hranili kapsulama od 250 mg koje sadrže H. erinaceus, iskusili su poboljšanje blagog kognitivnog oštećenja, što ukazuje da gljive mogu pomoći u sprečavanju demencije. Prerada, ali ne i uslovi gajenja, utiče na anti-mikrobni i anti-oksidativni potencijal H. erinaceus.

Glavni cilj ovog istraživanja je bio da se utvrdi približan sastav ekstrakta plodonosnog tela gljive H. erinaceus i da se detaljnije ispitaju mehanički aspekti u vezi sa suzbijanjem širenja ćelija U937 indukcijom apoptoze kroz aktiviranje mitohondrijski posredovane unutrašnje putanje kaspaze.

Rezultati

Inhibicija razvoja ćelija U937

Da bismo utvrdili da li su HWE i MWE citotoksični, testirali smo vitalnost ćelija testom MTT. Kao internu kontrolu, takođe smo testirali dva ekstrakta (ACE i AKE) koje nisu izazivali proizvodnju NO. Tretman sa HWE ili MWE je smanjio ćelijsku vitalnost na način zavisan od koncentracije dok ACE ili AKE nisu bili citotoksični. Ovi podaci podrazumevaju da su HWE ili MWE potencijalno uključeni u apoptozu ćelija U937.

Indukcija apoptoze u ćelijama U937

Dodatni eksperimenti su bili izvedeni da bi se saznalo da li je inhibicija razvoja usled HWE i MWE rezultat apoptotske ćelijske smrti. Prvo je frakcija obojenih ćelijskih populacija u različitim kvadrantima analizirana protočnom citometrijom. Proporcija jednostruko (FITC+, PI-) plus dvostruko pozitivnih (FITC+, PI+) ćelija, koja se sastoji od ranih ćelija apoptoze i kasnih ćelija apoptoze/nekrotičnih ćelija, povećana je na 54.5% i na 54.7% usled tretmana sa HWE i MWE, respektivno. Indukcioni nivoi su bili blizu onih kontrolnih nivoa tretiranih etopozidom koji su korišćeni da se demonstrira apoptoza.16 Dalje smo analizirali integritet genomske DNK i odnos hipodiploidnih ćelija. Tretman sa HWE ili MWE je izazvao pojavu hromozomske kondenzacije i apoptopskih tela bojenjem sa DAPI. Digestija genomske DNK u lestvici internukleozomalne fragmentacije je takođe primećena u ćelijama tretiranim samo sa HWE i MWE. Digestija uzoraka je bila slična onima indukovanih etopozidom.

Mi smo takođe, protočnom citometrijom merili promene u odnosu hipodiploidnih ćelija u tretiranim ćelijama. The sub-G1 sadržaji DNK ćelija U937 u 12 sati sa 500 mg/mL HWE ili MWE bili su 56.0% i 59.4%, respektivno. Hipodiploidne ćelije koje proističu iz tretmana HWE i MWE su povećane u zavisnosti od vremena. Ovi podaci pokazuju da HWE i MWE, ali ne ACE i AKE, deluju kao induktori apoptoze kod ćelija U937.

Ekspresija pro-apoptotičkih i anti-apoptotičkih proteina u ćelijama U937

Radi ispitivanja apoptotičke putanje aktivirane od strane HWE i MWE, analizom Western blot bila je analizirana ekspresija brojnih proapoptotočkih i anti-apoptotočkih proteina. Oba ekstrakta, i HWE i MWE, značajno su inhibirali manifestaciju apoptotočkih proteina uključujući Bcl-2, Bcl-xL(S), XIAP i cIAPs, pošto su nivoi manifestacije pro-apoptotski, ali ne XIAP Bad, Bid i Bax ostali praktično nepromenjeni. Ovi podaci ukazuju da je silazna regulacija anti-apoptotskih proteina, ali ne i uzlazna regulacija pro-apoptotskih proteina, uključena u HWE ili MWE apoptoze indukovane putem unutrašnje signalne putanje.

Smanjenje MMP i oslobađanje citohroma-c

Tretman ćelija sa HWE i MWE je doveo do značajnog pada pro-apoptotskog citohroma-c u mitohondrijama i istovremene pojave citohroma-c u citozolu, sugerišući oslobađanje citohroma-c iz mitohondrija u citozol. Tretmani su takođe značajno smanjili svoj MMP na 62.3 i 59.8%, respektivno, nivoe uporedive sa onima koje je izazvao etopozid. Ovi podaci ukazuju da HWE i MWE indukuju apoptozu ćelija U937 putem ometanja integriteta mitohondrijalne membrane.

Aktivacija kaspaza

Oba tretmana, i HWE i MWE, značajno su povećali aktivnosti kaspaze-9 (11.8- i 13.0- puta povećanje, respektivno) i kaspaze-3 (14.8- i 18.3- puta povećanje, respektivno) u poređenju sa grupom tretiranom prenosnim medijumom. Aktivnost kaspaze-8 je takođe povećana. Međutim, odnos indukcije aktivnosti kaspaze-8 je bio znatno manji nego kaspaze-3 i -9 (3.1- i 3.9- puta povećanje, respektivno). Mada, antigen-vezujuće specifičnosti antitela anti-kaspaze-8 i -9 nisu detektovale srodne pro-forme, Western blot analiza ukazuje da je degradacija njihovih pro-formi kritična za ekspresiju enzimske aktivnosti kaspaze-8, i -9 (kaspaze inicijatori) i kaspaze-3 (efektorske kaspaze). Aktiviranje kaspaze-3 je došlo paralelno sa proteolitičkim cepanjem PARP iz netaknutih molekula od 116 kDa u fragmente od 85 kDa. Indukcija HWE- ili MWE- posredovane apoptoze može biti u velikoj meri pripisana aktiviranju ,,inicijatora kaspaze’’ kaspaze-9. 

Suzbijanje indukovane apoptoze inhibitorom kaspaza-3

Da bi se potvrdilo da se HWE- ili MWE-indukovana apoptoza pojavila sa efektorskom funkcijom kaspaze-3 aktivirane prvenstveno inicijatorskom funkcijom kaspaze-9, ćelije su prethodno inkubirane sa DEVDCHO, IETD-CHO i LEHD-CHO, inhibitorima za kaspaze-3, -8, i -9, respektivno, pre tretmana. Pred-tretman sa inhibitorima kaspaze-3 ili -9 je efektivnije smanjio srodne enzimske aktivnosti nego sa inhibitorom kaspaze-8. Aktiviranje kaspaze-3 preko degradacije njegove pro-forme uglavnom preko kaspaze-9, igra ključnu ulogu u HWE i MWE indukovanoj apoptozi.

Diskusija

Sastav gljiva i ishrana

Gljive su dobar izvor kvalitetnih proteina, sadrže od 19 do 40% proteina po osnovu suve mase.17 U gljivama je pronađena većina esencijalnih aminokiselina i to u istoj proporciji kao u jajima. Sadržaj vitamina je takođe visok, slično kao kod kvasca, osim za tiamin. Otkrili smo da su za 4 ekstrakta H. erinaceus, sadržaji proteina, ugljenih hidrata i minerala (pepeo), svi bili visoki, u opsegu (u % suve mase) od 35.5 do 38.5; 33.8 do 39.5, i 14.6 do 19.0, respektivno. Sadržaj vlage je bio oko 8%, a sadržaj vlakna i masti manji od 1%. Gljive sa niskim sadržajem masti su dobar izvor esencijalnih hranljivih nutrijenata i mikronutrijenata. 

Činjenica da su vodeni i vodeno-etanolski ekstrakti bili visoko aktivni u svim biološkim testovima, dok su odgovarajući kiseli i alkalni ekstrakti sa sličnim približnim sastavom bili neaktivni ukazuje na to da apoptotsko jedinjenje nije stabilno na jako kisele ili jako alkalne uslove.

Mehanizmi apoptoze - opšti aspekti

Apoptoza se javlja prema regulisanom procesu koji uključuje aktivaciju ćelijskih događaja karakterisanih skupljanjem ćelija, manifestacije ćelijske površine fosfatidilserinom, kondenzacijom hromatina, fragmentacijom DNK i ćelijskom fragmentacijom u tela apoptoze. Fitohemikalije mogu indukovati apoptozu i pomoću unutrašnjih (mitohondrije) i pomoću spoljašnjih (receptor smrti) putanja. Unutrašnja putanja uključuje permealizaciju spoljne mitohondrijalne membrane i oslobađanje proapoptotskih faktora, dok spoljašnja putanja obuhvata interakcije između plazma membrane receptora smrti i liganda, koji zatim aktiviraju proteaze koje dovode do apoptozne ćelijske smrti. Za indukciju apoptoze, spoljašnje i unutrašnje putanje dele ekspresije oslobađanja citohroma-c i modulacije Bcl-2 familije proteina u mitohondrijama.

Činjenica da ekstrakti mekinja crnog pirinča pokazuju snažna antioksidativna, anti-inflamatorna i anti-karcinogena svojstva ukazuje da karcinogeneza takođe može biti uzrokovana oksidativnim i inflamatornim stresom na ćelijama posredstvom integrisanih Nrf2, NF-kBm i AP-1-signalnim putanjama. Apoptozni signal je obezbeđen jezgru interakcijom FasL, faktora nekroze tumora α (TNF-α) i liganda koji indukuje apoptozu u vezi sa faktorom nekroze tumora, sa svojim srodnim receptorima u membrani i naknadnom aktivacijom receptora smrti preko adaptera molekula i kaspaze-8.

U drugoj putanji, mitohondrijalno oslobađanje citohroma-c u citozol inicira mitohondrijalno posredovanu apoptozu.26 Unutar citozola, citohrom-c dovodi do aktivacije inicijatora apoptoza kaspaze-9 vezivanjem za APAF-1. Aktivirana kaspaza-9 zatim cepa neaktivnu prokaspazu-3 u aktivnog egzekutora kaspazu-3. Aktivirana kaspaza-3 potom cepa nekoliko podloga za kaspazu-3, kao što su poli (ADP-riboza) polimeraza (PARP) i D4-GDI. Ovaj događaj je usklađen sa fragmentacijom DNK i morfološkim promenama ciljnih ćelija. Pored toga, familija proteina Bcl-2 učestvuje kao ključni regulatori ćelijske smrti i funkcioniše bilo kao aktivator (Bax, Bcl-Xs, Bid, kao i Bad) ili kao inhibitor [(Bcl-2 i Bcl-XL(S)] u kontroli ćelijske smrti što dovodi do tumorogeneze.

Apoptogenetski mehanizmi ekstrakata gljiva

Dosadašnji nalazi ukazuju da su HWE ili MWE ispoljili direktne citotoksične efekte protiv razvoja kancer ćelija. Druga ćelijska linija humanih T-ćelija leukemije (Molt-4) je takođe inhibirana na 47% i 44%, respektivno, tretmanima sa 500 mg/mL HWE i MWE (Tabela 2). Međutim, murinska leukemiska ćelijska linija (L1210) i normalnih NIH-3T3 murinski fibroblast i HGF-1 humanih fibroblastične ćelije pokazale su pad od samo 5 do 8% nakon izlaganja HWE ili MWE. Iako ne znamo zašto HWE i MWE prvenstveno indukuju smrt ćelija ljudskog porekla, jedna mogućnost je da bi selektivna smrt kancer ćelija mogla biti povezana sa indukcijom proizvodnje NO kod ciljnih ćelija. Nekoliko studija je pokazalo da selektivna citotoksičnost nastaje zbog niskog nivoa antioksidativnih enzima kod kancer ćelija. Ovakve ćelije nude konkurentnu prednost stvaranju toksičnih reaktivnih kiseoničnih i azotnih vrsta. Ako anti-oksidativni kapacitet postaje fatalno ograničavajući onda oksidativni ili nitrosativni stres može da ispolji citotoksične efekte na raka, ali ne i na normalne ćelije.

Sledeće opservacije pojačavaju zaključak da citotoksičnost specifična za kancer ćelije izazvana tretmanima sa HWE ili MWE funkcioniše kroz apoptozu. Prvo, protočna citometrija na Annexin V-obeleženim ćelijama je pokazala brz prenos i akumulaciju membranskog fosfatidilserina od unutrašnje ka spoljašnjoj strani listića membrane. Drugo, korišćenje tretiranih ćelija obeleženih sa DAPI je otkrilo izgled jezgara sa kondenzovanim hromatinom i apoptotičkim telima. Treće, tretmani su izazvali digestiju genomske DNK u „merdevine” DNK od 200 baznih parova. Četvrto, protočna citometrija profila DNK tretiranih ćelija je pokazala povećanu akumulaciju hipodiploidnih ćelija u fazi sub-G1. Na kraju, zaustavljeni obrazac ćelijskog ciklusa ovih ćelija je bio sličan onom kod kontrolnog, koji je tretiran etopozidom.

Jedan od ciljeva ovog istraživanja je bio da se sazna da li je apoptoza indukovana ekstraktima HWE ili MWE povezana sa silaznom regulacijom Bcl-2, Bd-xL i Bcl-xS kao i drugi anti-apoptotski proteini, uključujući XIAP i cIAPs. Kao što je očekivano, tretmani su indukovali obeleženu silaznu regulaciju antiapoptotskih proteina familije Bcl-2. Nasuprot tome, proapoptotski nivoi proteina familije Bcl-2, uključujući Bad, Bid i Bax, su bili samo marginalno menjani. Tretmani su takođe povećali odnos [proapoptotski protein]/[anti-apoptotski proteini] i indukovali gubitak MMP, što dovodi do apoptoze zbog disfunkcije mitohondrija.

Iako ispitivana hemijska heterogenost svakog ekstrakta H. erinaceus otežava definisanje precizne apoptotičke signalne putanje, sadašnji podaci pružaju dokaz za pretežno uključivanje mitohondrijalne putanje kroz aktiviranje ,,inicijatora” kaspaze-9. Podaci isključuju mogućnost da oba ekstrakta, HWE i MWE, indukuju apoptozu posredovanu receptorom smrti zbog neuspeha da se otkrije cepani proizvod Bid i značajno niske nivoe aktivnosti kaspaze-8 u odnosu na aktivnosti kaspaze-9.

Na osnovu navedenih rezultata, predlažemo da mitohondrijalna apoptotska putanja pokrenuta ekstraktima HWE i MWE, aktivira ,,inicijator” odnosno kaspazu-9, koja zauzvrat aktivira kaspazu-3. Ekstrakti HWE i MWE su indukovali translokaciju oslobađanja citohroma-c iz mitohondrije u citozol, verovatno zbog smanjene manifestacije anti-apoptotočkih proteina bez ikakvih značajnih promena u pro-apoptotočkim ekspresijama proteina. Ovi događaji zatim dovode do aktivacije kaspaza-9 i -3, zajedno sa istovremenim cepanjem PARP-a ali bez obeleženog aktiviranja kaspaze-8. Ovaj mehanizam je takođe podržan donjim inhibitornim efektom kaspaze-8 inhibitora na srodnu aktivnost enzima u poređenju sa inhibicijom zapaženom sa inhibitorima kaspaze-3, i -9.

Zaključci

Trenutni rezultati ukazuju da vodeni i vodeno/etanolski ekstrakti HWE i MWE H. erinaceus, koji su indukovali proizvodnju NO u ćelijama makrofaga, su snažno suzbili proliferaciju U937, ali ne i normalne ćelije indukcijom apoptoze aktiviranjem mitohondrijski posredovane putanje kaspaze. Dva kisela i bazna ekstrakta (ACE i AKE), koji nisu indukovali proizvodnju NO, su bili neaktivni u svim biološkim testovima, ukazujući da su aktivni sastojci gljiva nisu stabilni u jakim kiselim ili baznim uslovima. Naši podaci ukazuju da su oba ekstrakta, HWE i MWE, gljive H. erinaceus, povećali nivoe pro-apoptotskog proteina (Bax, Bad i Bid) u odnosu na apoptotske proteine {(Bcl-2, Bcl-xL(S) i cIAPs)}, na taj način promovišući apoptozu kod ćelija ljudske leukemije U937. Ova razmatranja ukazuju na to da cele gljive ili aktivni ekstrakti zaslužuju dalje proučavanje zbog mogućeg terapeutskog potencijala protiv ljudske leukemije. Konačno, ova studija dopunjuje prethodna zapažanja u vezi anti-karcinogenog potencijala drugih biljnih jedinjenja, uključujući sastojke čaja i glikoalkaloide krompira i paradajza.

Nema proizvoda u ovoj kategoriji.

Budizdrav © 2019. UKION SHOPS